Mikrobiyolojide Yeni Çağ: MALDI-TOF MS İle Hızlı ve Güvenilir Tanılama

MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), kütle spektrometresi genellikle proteinler, peptitler, lipitler ve polimerler gibi büyük biyomoleküllerin analizinde kullanılan bir kütle spektrometresi teknolojisidir. İşte bu teknolojinin bazı temel bileşenleri ve işleyişi hakkında bilgiler:

Temel Bileşenler ve İşleyiş

Matrix Preparation (Matris Hazırlığı):
- Numune, organik bir matriks ile karıştırılır. Matriks, lazer ışığını absorbe eder ve numuneyi iyonize eder.
- Genellikle kullanılan matriksler arasında sinapinic asit, alfa-siyanohidroksisinamik asit ve dihidroksibenzoik asit bulunur.
Laser Desorption/Ionization (Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon):
- Hazırlanan numune, lazer ışını ile vurulur. Lazer, matriks moleküllerini buharlaştırarak ve numune moleküllerini iyonize ederek analitik duruma getirir.
- Bu süreçte numunedeki büyük moleküller (örneğin proteinler) matriks tarafından korunduğundan, bu moleküller yüksek enerjiden zarar görmez.
Time-of-Flight Analyzer (Uçuş Zamanı Analizörü):
- İyonize olan moleküller, bir elektrik alanı aracılığıyla hızlandırılır ve uçuş tüpüne gönderilir.
- İyonların tüp içerisindeki uçuş süreleri, kütle/yük oranlarına (m/z) bağlı olarak ölçülür. Daha küçük ve hafif iyonlar daha hızlı hareket ederken, daha büyük ve ağır iyonlar daha yavaş hareket eder.
Detector (Dedektör):
- Uçuş tüpünün sonunda yer alan dedektör, iyonların varış zamanlarını ölçer ve bu verileri kullanarak bir kütle spektrumu oluşturur.
- Bu spektrum, numunedeki farklı bileşenlerin kütle/yük oranlarına göre dağılımını gösterir.

Uygulamalar

Proteomik: Proteinlerin tanımlanması ve karakterizasyonu.
Mikroorganizma Tanımlama: Özellikle bakteriyel türlerin hızlı ve doğru tanımlanması.
Biyomarker Keşfi: Hastalıkların teşhisi için potansiyel biyomarkerların belirlenmesi.
Farmasötik Araştırmalar: İlaç metabolitlerinin ve farmasötik bileşiklerin analiz edilmesi.

Avantajlar

Hızlı ve yüksek doğrulukta analiz yapabilme.
Minimal numune hazırlığı gerektirir.
Çeşitli biyolojik ve kimyasal numuneleri analiz etme kapasitesi.

Dezavantajlar

Düşük çözünürlük (özellikle yüksek kütle/yük oranlarında).
Düşük miktarda analit içeren numunelerde hassasiyet sorunları.
İyon bastırma etkileri ve matriks etkileri gibi bazı analitik problemler.

MALDI-TOF MS teknolojisi, biyolojik ve kimyasal analizlerde geniş bir uygulama yelpazesi sunar ve modern bilimde önemli bir araç haline gelmiştir.

Bu amaçla, Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi Bitki Sağlığı Kliniği Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde hizmet verilmekte olan MALDI TOF MS cihazı ile mikroorganizma tanımlaması yapılmaktadır. Özellikle bitki bakteri patojenlerinden oluşan database (kütüphane) ile Türkiye’ de tek merkez olarak hizmet verilmektedir.

Günümüzde, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometresi (MS), Mikrobiyolojik çalışmalarda, türler bazında bitki ile ilişkili mantar, bakteri ve mayaların tanımlanmasında güncel tanımlama tekniklerine doğru bir alternatif sunan, hızlı, kullanımı kolay başarılı bir analitik teknik olarak kabul edilmiştir. MALDI-TOF MS tarafından yapılan mikroorganizma analiz prosedürleri teknik olarak basit ve hızlıdır. Ayrıca, geniş bir yelpazedeki önemli mikroorganizmaların tanımlanması için tekrarlanabilir ve ticari veri tabanları mevcuttur. MALDI-TOF MS, doğrudan bozulmamış bakteri, mantar ve mayadan spesifik peptidleri veya proteinleri analiz eder (Chalupová ve ark., 2014; Carolis ve ark., 2012).

Şekil 1. MALDI TOF MS cihazı (Uysal, A., 2019)

Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi Bitki Sağlığı Kliniği Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde hizmet verilmekte olan, Matrix asisted laser desorption ionization- time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) Mikroorganizma Tanımlama cihazında etanol formik asit ekstraksiyonu yöntemi ile elde edilen proteinler protein parmak izi eşleşmesi şeklinde kütüphane taraması yapılarak mikorganizmaların (bakteri, maya ve fungus) tanısı ortaya konulmaktadır. Cihazın flex kontrol yazılım programı (Biotyper 3.0; Microflex LT; Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany) ile elde edilen spektrumlar, Maldi Biotyper Real-Time Classification (RTC) yazılımı (version.9) ile karşılaştırılarak tanı işlemi sürdürülmüştür. Analiz sonucunda, 1.700-3.000 arasında sarı/yeşil renkli olarak belirlenen veriler, güvenilir skor değeri olarak kabul edilmektedir. ( Uysal ve ark., 2018;Uysal, 2019; Uysal ve ark., 2020; Uysal ve ark. 2022).

Şekil 2. MALDI-TOF MS analiz tekniğinde iş akışını gösteren diagram (Uysal, A., 2019)

Bakteri örneklerinden elde edilen taze koloniler, MALDI TOF (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization Time-Of-Flight ) ile tanımlama yapılmak üzere Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi, Bitki Sağlığı Kliniği Uygulama ve Araştırma Merkezi’ne gönderilmiştir. Bu merkezde MALDI-TOF analizi ile mikroorganizma tanımlaması Uysal ve ark. (2019, 2020, 2022)’ndaki prosedür kullanılarak uygulanmıştır. Bunun için saf bakteri kültürlerinden ön protein izolasyonları yapılmış ve bu proteinlerin analizi sonucunda cihazdan elde edilen spektrumlar aracılığıyla cins ve tür teşhis işlemleri gerçekleştirilmiştir.

Şekil 3. MALDI TOF MS cihazında MALDI Biotyper Real-Time Classification (RTC) programındaki tanı skalası (A) ve izolatlarının protein profillerinin kütle spektrumları (B) (Uysal, A., 2019)

İnsan, hayvan, çevre, gıda, bitki vb. numunelerden elde ettiğiniz bakteri, maya ve küf kültürlerini, cins ve tür bazında teşhisini ‘hızlı, kesin, pratik ve düşük maliyetle’ yaptırmak istediğiniz zaman Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi, Bitki Sağlığı Kliniği Uygulama ve Araştırma Merkezi’ne (BİSAK) irtibata geçebilirsiniz..